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Las Fitohormonas: aliados en la agricultura

Las fitohormonas son compuestos orgánicos de origen vegetal que regulan el desarrollo y crecimiento de las plantas y se han empleado en la agricultura desde principios del siglo XX. 

Algunas de ellas, como son las giberelinas, citocininas y auxinas tiene funciones conocidas y su uso comercial depende del proceso de la planta que se desee regular.  

imagen de apoyo fitohormonas

Las fitohormonas se emplean en diversos cultivos, entre ellos los que constituyen rubros económicos importantes, como los de tabaco, chile pimiento, manzana, uva, perejil, caña de azúcar, cítricos, plantas ornamentales, entre otros.  

Las aplicaciones dependen de la funcionalidad de cada tipo de fitohormona, por ejemplo:  

Las auxinas: Se utilizan para regular la caída de frutos y pétalos de flores. Inducen el desarrollo floral en varias especies. Se utilizan para obtener frutos sin semillas como tomates, higos y sandías. 

Las giberelinas: Aceleran la entrada de la planta a la etapa de floración en condiciones muy tempranas, aun cuando la planta no haya culminado su fase juvenil. Se utilizan para incrementar el tamaño del fruto, lo que incide directamente en la calidad y en el precio. Retardan la senescencia de los frutos para mantener más tiempo los frutos en los árboles, o si ya están cosechados, para extender el período de su comercialización. Estimula el crecimiento de la caña de azúcar y el contenido de sacarosa. 

Las citocininas: Retarda la senescencia, por lo que se utiliza para dilatar y mantener por más tiempo la vida de las flores con hojas, alarga los periodos de crecimiento en el tomate. 

Es importante saber que, para lograr los efectos deseados hay que definir cuál o cuáles hormonas se requieren, así como la cantidad y concentración necesaria para poder manipular el proceso que se desea regular. 

Todo ello repercute en un mejor aprovechamiento de los cultivos y de forma favorable en la economía agrícola.  

ATCAE ofrece el servicio de análisis de giberelinas, citocinas y/o auxinas por HPLC, si requieres de estos servicios o de asesorías sobre la determinación analítica, contáctanos a través de nuestra página www.atcae.com.mx

Nancy Pentón Piña 

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POPULARIDAD DE LA PCR EN EL 2020

La fama de la PCR en el 2020 

El término PCR se volvió famoso entre la población en el año 2020 debido a la pandemia de COVID-19 causada por el virus SARS-CoV-2. Si bien este término y la tecnología detrás de éste se conocen ampliamente desde su desarrollo en 1983, su uso fue limitado al ámbito científico y académico del área químico-biológica. 

Actualmente el término PCR lo emplea casi cualquier persona para referirse a la prueba diagnóstica para la detección de SARS-CoV-2. Sin embargo, su uso para referirse a esta prueba diagnóstica simplifica la terminología de la técnica que realmente se emplea para detectar este virus, y la cual es conocida como RT-PCR en tiempo real o RT-qPCR

PCR vsqPCR 

La PCR (del inglés “Polymerase Chain Reaction”) es también conocida como PCR de punto final. En esta técnica molecular se generan millones de copias (amplificación) de un fragmento de ADN que son detectadas al final de la reacción generalmente por electroforesis en gel de agarosa. 

Por otro lado, la PCR en tiempo real o PCR cuantitativa, abreviada como qPCR de acuerdo con la guía MIQUE, combina la amplificación y detección simultánea de un fragmento de ADN sin la necesidad de una electroforesis.  

A diferencia de la PCR, en la qPCR se emplean moléculas fluorescentes (fluorógenos) que se intercalan en la doble hebra del ADN sintetizado o sondas, también fluorescentes, que hibridan (interaccionan) con el producto amplificado. El producto amplificado en cada ciclo de la PCR emite una señal de fluorescencia proporcional al ADN molde inicial permitiendo su cuantificación. Además, la amplificación o síntesis del ADN se detecta de inmediato (tiempo real).

Esta característica hace de la qPCR una técnica muy sensible y relativamente rápida para la detección y cuantificación de un ADN específico.

La qPCR es una herramienta muy útil y extremadamente sensible empleada en la práctica e investigación clínica, biológica, biomédica e industrial. 

RT-PCR vs. RT-qPCR 

La técnica de RT-PCR involucra la reacción de transcripción reversa (RT) a partir de ARN para generar una molécula de ADNc (ADN complementario). El ADNc obtenido sirve de molde para generar millones de copias del ADNc por PCR. Por tal razón, el término RT-PCR se refiere al ensayo de retrotranscripción o RT acoplado a la PCR y puede realizarse en una o dos etapas.  

Igual que la PCR, la técnica de RT-PCR se viene usando desde los años 80s del siglo pasado.  

Es ahora simple explicar que la RT-qPCR implica una reacción de RT acoplada a una PCR en tiempo real o qPCR.  

Estas cortas descripciones permiten comprender la diferencia entre PCR, qPCR, RT-PCR y RT-qPCR.

RT-qPCR

El ensayo de RT-PCR o RT-qPCR se puede realizar en una o dos etapas, dependiendo si se separa la reacción de RT de la de PCR. 

RT-PCR
Diferencias entre los ensayos de RT-PCR, qPCR y RT-qPCR. 
Imagen modificada de Biochem (Lond) 22 June 2020; 42 (3): 48–53. doi: https://doi.org/10.1042/BIO20200034

La prueba PCR para COVID-19 

Ya que SARS-CoV-2 es un retrovirus, la prueba de PCR para COVID-19 se basa en la detección de la presencia del material genético del virus, el ARN.  

Por tal razón, se requiere obtener el ARN viral de una muestra (suele ser de secreciones respiratorias), convertir el ARN en ADNc mediante RT y una amplificación por PCR, es decir realizar una RT-PCR. 

A pesar de que la RT-PCR ha sido empleada para la detección de diversas infecciones respiratorias, RT-qPCR es la técnica recomendada por la Organización Mundial de la Salud (OMS) y la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) para realizar el diagnóstico de COVID-19.

La ventaja que ofrece la RT-qPCR en la detección del material genético del virus SARS-CoV-2 se sostiene en tres aspectos fundamentales: 

  • Especificidad: se emplean sondas fluorescentes dirigidas a secuencias cortas de genes de SARS-CoV-2 (los genes RdRpORF1abN1, N2 y N3, y E) con capacidad de diferenciar entre otros virus muy cercanos evolutivamente. 
  • Sensibilidad: debido a su límite de detección, puede detectar hasta 10 copias del material genético viral por reacción. 
  • Diagnóstico oportuno: debido a su sensibilidad es posible detectar el virus al inicio de la infección.  
PCR-COVID2

Flujo simplificado del ensayo de RT-qPCR para la detección de SARS-CoV-2. 

Así entonces, emplear el término PCR para la detección de SARS-CoV-2 simplifica la verdadera tecnología innovadora detrás de la técnica de RT-qPCR. Esta tecnología ha brindado un gran beneficio en el control de la pandemia de COVID-19 y nos ha hecho reflexionar sobre la importancia de la Biotecnología en el desarrollo del quehacer humano.  

Si te ha resultado interesante el tema y quieres ampliar sobre el mismo contáctanos a través de nuestra página www.atcae.com.mx.  

JM Viader-Salvadó 

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Cromatografía de líquidos de alta resolución

La técnica de HPLC de las siglas en inglés “High-performance liquid chromatography” es también denominada cromatografía de líquidos de alta resolución, antes llamada como cromatografía de alta presión y actualmente es más conocida como cromatografía líquida de alta eficiencia.  

Si lo pensamos bien, tanto alta presión, alta resolución, como alta eficiencia son terminologías que entran dentro de la descripción de HPLC, pero el de alta eficiencia va justo a la esencia. 

La HPLC es una técnica muy versátil, por lo que es ampliamente utilizada como técnica analítica para separar, identificar y cuantificar los componentes de una mezcla.

Aplicación de la HPLC  

Mediante el análisis por HPLC se identifican y cuantifican diversos tipos de productos como fármacos, antioxidantes, fitohormonas, carbohidratos y sus derivados, entre otros, con la finalidad de evaluar la calidad de materias primas, productos intermedios y/o productos terminados.  

También se utiliza en procesos productivos a escala industrial. En mi experiencia, con el proceso de purificación de una proteína por cromatografía de intercambio iónico convencional, la pureza de las fracciones puede ser determinada en tan solo 30 min por cromatografía de fase reversa en HPLC (RP-HPLC) a escala analítica. 

Con esta determinación analítica se seleccionan las fracciones cumplen con las especificaciones de pureza para continuar con el proceso productivo y obtener un producto inyectable. 

La HPLC también se puede emplear para el análisis de proteínas por cromatografía de filtración en gel (GF-HPLC), un tipo cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). 

Este tipo de cromatografía emplea partículas porosas en la columna para separar a las moléculas en función de su tamaño en solución.

La cromatografía de filtración en gel se usa también de forma preparativa para purificar proteínas multiméricas en su estado nativo, sin provocar su desnaturalización, en las últimas etapas de pulido de un proceso industrial para la producción de un ingrediente farmacéutico activo.

¿Por qué la HPLC es una técnica de separación excepcional? 

Un ejemplo curioso que está descrito en un manual de Vydac sobre RP-HPLC me hizo entender cuan poderosa resulta la técnica de HPLC como técnica de separación. 

En este se describe que por medio de la separación por RP-HPLC es posible separar variantes de insulina de diferentes especies en una elución cromatográfica de 25 min. 

La diferencia de estas variantes de insulinas es de tan solo uno o dos residuos de aminoácidos. Así, fue posible separar la insulina de conejo de la de humano, las cuales se diferencian en el remplazo de una treonina por una serina, estos aminoácidos solo se diferencian en un grupo metilo. 

Serina Treonina

¿Cómo es posible alcanzar tan alta eficiencia o resolución?  

Es increíble que la esencia de la alta resolución en el HPLC radica en el tamaño de las partículas que forman parte de la matriz cromatográfica.  

La disminución del tamaño de la partícula hizo que evolucionara la tecnología. Se pasó de las partículas porosas grandes (100 µm) en columnas de vidrio abiertas y aplicación por gravedad a partículas cada vez más rígidas y pequeñas de sílica hasta de 2 µm (desarrollo histórico del HPLC).

Esto hizo más compacto el empaque del lecho cromatográfico y generó mayor diferencial de presión al paso de la fase móvil, por lo que fue necesario desarrollar bombas de alta presión, columnas de acero que soportaran la presión, y capilares y conectores resistentes.  

De este modo, se fue desarrollando la tecnología del HPLC que propició un salto significativo en la reducción del tiempo de análisis y el aumento de la resolución durante la separación de los componentes de la muestra. 

Evolución del tamaño de las partículas

Si te ha resultado interesante el tema y aún tienes dudas o requieres llevarlo a la práctica, en ATCAE estamos para apoyarte.  

Nancy Pentón Piña