La técnica de HPLC de las siglas en inglés “High-performance liquid chromatography” es también denominada cromatografía de líquidos de alta resolución, antes llamada como cromatografía de alta presión y actualmente es más conocida como cromatografía líquida de alta eficiencia.
Si lo pensamos bien, tanto alta presión, alta resolución, como alta eficiencia son terminologías que entran dentro de la descripción de HPLC, pero el de alta eficiencia va justo a la esencia.
La HPLC es una técnica muy versátil, por lo que es ampliamente utilizada como técnica analítica para separar, identificar y cuantificar los componentes de una mezcla.
Aplicación de la HPLC
Mediante el análisis por HPLC se identifican y cuantifican diversos tipos de productos como fármacos, antioxidantes, fitohormonas, carbohidratos y sus derivados, entre otros, con la finalidad de evaluar la calidad de materias primas, productos intermedios y/o productos terminados.
También se utiliza en procesos productivos a escala industrial. En mi experiencia, con el proceso de purificación de una proteína por cromatografía de intercambio iónico convencional, la pureza de las fracciones puede ser determinada en tan solo 30 min por cromatografía de fase reversa en HPLC (RP-HPLC) a escala analítica.
Con esta determinación analítica se seleccionan las fracciones cumplen con las especificaciones de pureza para continuar con el proceso productivo y obtener un producto inyectable.
La HPLC también se puede emplear para el análisis de proteínas por cromatografía de filtración en gel (GF-HPLC), un tipo cromatografía de exclusión por tamaño (SEC).
Este tipo de cromatografía emplea partículas porosas en la columna para separar a las moléculas en función de su tamaño en solución.
La cromatografía de filtración en gel se usa también de forma preparativa para purificar proteínas multiméricas en su estado nativo, sin provocar su desnaturalización, en las últimas etapas de pulido de un proceso industrial para la producción de un ingrediente farmacéutico activo.
¿Por qué la HPLC es una técnica de separación excepcional?
Un ejemplo curioso que está descrito en un manual de Vydac sobre RP-HPLC me hizo entender cuan poderosa resulta la técnica de HPLC como técnica de separación.
En este se describe que por medio de la separación por RP-HPLC es posible separar variantes de insulina de diferentes especies en una elución cromatográfica de 25 min.
La diferencia de estas variantes de insulinas es de tan solo uno o dos residuos de aminoácidos. Así, fue posible separar la insulina de conejo de la de humano, las cuales se diferencian en el remplazo de una treonina por una serina, estos aminoácidos solo se diferencian en un grupo metilo.
¿Cómo es posible alcanzar tan alta eficiencia o resolución?
Es increíble que la esencia de la alta resolución en el HPLC radica en el tamaño de las partículas que forman parte de la matriz cromatográfica.
La disminución del tamaño de la partícula hizo que evolucionara la tecnología. Se pasó de las partículas porosas grandes (100 µm) en columnas de vidrio abiertas y aplicación por gravedad a partículas cada vez más rígidas y pequeñas de sílica hasta de 2 µm (desarrollo histórico del HPLC).
Esto hizo más compacto el empaque del lecho cromatográfico y generó mayor diferencial de presión al paso de la fase móvil, por lo que fue necesario desarrollar bombas de alta presión, columnas de acero que soportaran la presión, y capilares y conectores resistentes.
De este modo, se fue desarrollando la tecnología del HPLC que propició un salto significativo en la reducción del tiempo de análisis y el aumento de la resolución durante la separación de los componentes de la muestra.
Si te ha resultado interesante el tema y aún tienes dudas o requieres llevarlo a la práctica, en ATCAE estamos para apoyarte.
Nancy Pentón Piña
